高效液相色谱柱的选择方法与注意事项
选择方法
根据样品性质:
极性:极性样品多选择正相色谱柱,如硅胶柱;非极性样品则更适合反相色谱柱,如 C18 柱。
分子量:分析大分子量化合物,一般选择大孔径色谱柱,如 300A 孔径的柱子,以保证分子能够自由进出填料孔。
酸碱性:对于高 pH 值或者碱性化合物,需要选择高封端或者特殊封端的色谱柱,以改善峰形,延长色谱柱使用寿命。
考虑色谱柱参数 :
柱长:柱长越长,总柱效越高,但分析时间也越长。一般 250 - 300mm 是较普遍的柱长,可用于分离 10 到 50 个组分的中等至复杂混合物;若要求更高分辨率,可选择 500 - 600mm 的柱子。
内径:内径越小柱效越高,但柱容量越小;内径越大,柱容量增加,允许进样量就越多。实验室常用的柱子内径一般是 4.6mm。
粒径:粒径越小,分离越快,柱效越高,但柱压力越高,柱容易被污染,导致柱寿命降低。常见分析柱通常使用 5um 填料,复杂多组分样品分离一般使用 3.5um 粒径。
孔径:孔径需和分子大小相匹配,通常要求孔径直径是分子直径的 3 倍以上,小分子一般使用 80 - 120A 孔径,大分子使用 300A 孔径。
载碳量:载碳量高,则保留增加,适合分析非极性化合物。
键合相:键合试剂不同,对化合物的选择性不同,一般长链的烷基键合相(C18、C8)比短链的(C4、C3)稳定;非极性的键合相比极性的键合相(-NH2)稳定。
依据分离目标:如果是进行定性分析,对分离度要求相对较低,可选择常规的色谱柱;
若是定量分析,则需要更高的分离度和重复性,以确保结果的准确性,可能需选择性能更优的色谱柱。对于复杂混合物的分离,需要选择高分辨率的色谱柱;而对于简单样品,可选择较短柱长、较大粒径填料的色谱柱,以缩短分析时间。
考虑流动相兼容性:
要确保所选色谱柱能承受使用的溶剂和缓冲液。如硅胶基质柱的流动相 pH 值一般应在 2 - 8 之间,若使用极端 pH 值的流动相,则需选择相应的耐酸或耐碱填充剂。
关注厂家和型号:
不同厂家生产的液相色谱柱,即使是相同类型,其性能和质量也可能有所差异,这是因为各厂家的填料技术和键合技术不同。因此在选择时,应根据实验需求、预算和厂家的技术支持能力,选择合适的厂家和型号。
注意事项
柱效和保护柱:新柱使用前应测试柱效并保存相关数据,以便日后对比。在线监测时,应安装在线过滤器、自装填料保护柱或预装保护柱,为色谱柱提供物理和化学保护,防止杂质污染柱子。
清洗:使用后需根据不同样品的特点,选择合适的清洗方案和溶剂,如甲醇、二氯甲烷、正庚烷等,及时清洗色谱柱,以去除残留物质,防止堵塞和污染。
存放:存放前要去除杂质和盐,选择合适的存放溶剂,避免色谱柱床干枯,同时要防止机械振动和细菌生长。
操作条件控制:要注意控制温度、流速、压力等操作条件,避免超出色谱柱的承受范围。以硅胶为载体的普通键合固定相的使用温度不应超过 35℃,特殊情况可适当提高,但不得超过 60℃;操作压力一般为 100 - 6000psi,操作时需保持稳定,避免波动。